(相关资料图)
多年来，加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授凯文·D·科贝特（）教授课题组，主要研究真核生物 Horma 和 Trip13，这些蛋白在有丝分裂、减数分裂和 DNA 修复中起着重要作用。 2015 年，有论文称细菌中也有这些蛋白组分，这引起了他的注意。为此，他和课题组于 2016 年开启了相关研究。
在此之前，该团队的叶巧真博士曾解析了线虫和人类的 Trip13 的结构。她说：“这让我成为这项研究的主力之一，后来我解析了包括 CD-NTase/Horma/Trip13 复合体结构在内的多个蛋白的晶体结构，并于 2020 年在 Molecular Cell 上以背靠背的形式发表了两篇论文。这一途径后被称为 Type III CBASS。”
图|从左到右：叶巧真、（Kevin D. Corbett）。摄于 2021 年 7 月，恰逢 在加州大学圣地亚哥分校建组 10周年（来源：资料图） CBASS (cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling systems) 是细菌的一个免疫途径，包含 Type I、Type II 、Type III 和Type IV 四种类型，也是人类 cGAS-STING 免疫途径的前身。
cGAS-STING 是人体的一个固有免疫途径，其中 cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) 可以感知外界病毒入侵并合成环状寡核甘酸 cGAMP (cyclic GMP-AMP)，进而激活基于 STING (stimulator of interferon genes) 的抗病毒反应。
据悉，和 cGAS 类似的蛋白 CD-NTase (cGAS/DncV- like nucleotidyltransferases) 受到感应病毒的侵袭之后，会产生多种环状寡核苷酸信使，进而会激活相关酶去杀死被噬菌体感染的细菌，这一细菌免疫过程被称为 CBASS。
2020 年， 利用生物信息学分析技术，发现 Type II (long) CBASS CD-NTase 的 C-端具有保守的甘氨酸或丙氨酸，和泛素分子的 C-端双甘氨酸相似，难道 CD-NTase 有泛素分子的性质？
他敏锐地发现这会是一个开创性的研究课题，立马联系了美国科罗拉多大学博尔德分校生物化学系助理教授亚伦·怀特利（），他们一拍即合，迅速开展了研究。
在课题探索阶段，研究团队认为如果 CD-NTase 在此途径中是泛素分子，而 E1-E2 融合蛋白 Cap2 是泛素转移酶，那么 Cap2 应该可以利用 ATP 腺苷化 CD-NTase 的 C-端，从而共价结合到 Cap2 的活性位点的半胱氨酸上。
为此，叶巧真分别纯化了两种蛋白，但是混合之后并没有观察到它们高分子的结合物，难道这项猜测是错误的？
后来，她把两个蛋白的基因同时构建在同一个质粒上，以便在细菌里共表达，借此她观察到高分子量的蛋白带，这说明它们的确能共价结合在一起。
后来，加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授实验室的全韵博士，使用蛋白质谱方法证明该高分子量条带同时包含 CD-NTase 和 Cap2，并鉴定到在 Cap2 上被 CD-NTase C-端修饰的位点，从而验证了课题组的原始猜想。
接下来便是结构研究：他们先是设计了 Cap2 E1 部分和 CD-NTase C-端 370-381 片段的融合蛋白，并很快获得了 2.8 埃的晶体数据，但是结构无法获得解析。后来 AlphaFold 面世，于是叶巧真根据结构预测，进一步对融合蛋白的设计进行优化，获得了 1.7 埃的更高分辨晶体数据，从而解析了这一结构。
同时，研究团队也获得了 Cap2 和 CD-NTase 复合体的结构。
另据悉，活性状态的复合体比较不稳定，因此难以获得均一的样品，而理想状态是要突变 Cap2 的活性位点。但这也会带来一定困难：突变了活性位点之后，也会同时降低两个蛋白的亲和性。原因在于，Cap2 的活性位点往往也位于 CD-NTase 的结合位点附近。
经过对多种菌株 Cap2 和 CD-NTase 复合体的筛选、以及对于各种突变位点的尝试，叶巧真终于拿到了 Cap2 在失活状态下和 CD-NTase 稳定结合的复合体，并获得了 3.9 埃的晶体数据。
进一步地，在 实验室的顾亚杰博士的助力下，通过采用冷冻电镜技术，他们解析了 2.7 埃的 Cap2 和 CD-NTase 复合体结构。
然后进入生物化学方面的研究：包括研究 Cap2 和 CD-NTase 的相互作用，以及研究 Cap3 对于 CD-NTase 和 Cap2/CD-NTase 复合体的作用等。
接下来则是噬菌体分析、以及寻找 CD-NTase 的靶目标。“这两步主要是合作者 Whiteley 课题组在做。我们两个实验室都是首次对泛素系统进行研究，相信他们和我们一样也遇到了不少困难。”
最终，他们解析了 type II (long) CBASS 的作用机制，首次验证了在细菌中存在泛素系统，填补了这一领域的空白。而且经过确凿可信的结构对比，得出了真核生物非经典通路的泛素系统起源于细菌的结论。
近日，相关论文以《E1–E2 融合蛋白启动细菌中的抗病毒免疫信号》（）为题发在
Nature 上 [1]。
图 | 相关论文（来源：
Nature）
科罗拉多大学博尔德分校生物化学系汉娜·莱德维娜（Hannah E. Ledvina）博士、以及叶巧真博士是共同一作，加州大学圣地亚哥分校细胞与分子医学系教授凯文·D·科贝特（）教授、美国科罗拉多大学博尔德分校生物化学系助理教授亚伦·怀特利（）担任共同通讯作者。 据了解，在该论文中最重要的数据便是高质量的 Cap2/CD-NTase 复合物的结构。针对 CBASS 系统，这些新颖的数据提供了关于重要蛋白的相互作用和功能的分子细节。
在该工作里，关于噬菌体感染的研究上，课题组也给出了令人信服的酶学结论，为通过噬菌体治疗该类细菌所导致疾病提供了可靠依据。
据了解，细菌免疫是近年来兴起的学科领域, 相关研究成果大大开阔了人们的视野：
第一，这让人们可以向细菌取经：CRISPR-Cas 是细菌免疫的一个途径，通过研究人们发现了基因组编辑工具，该技术目前已广泛用于基础生物学研究、生物技术产品的开发和疾病治疗，相关学者已于 2020 年获得了诺贝尔化学奖。
第二，可以帮助人们找出进化的印迹：Type II (long) CBASS 中的 E1 和 E2 及 Type III CBASS 中的 Horma 和 Trip13，都是首先在真核生物中发现，对细菌中的这些蛋白进行研究，能让学界更深入地了解其进化机理。
第三，噬菌体有望用于细菌病的治疗：CBASS 细菌免疫途径最终的结果是被感染的细菌与噬菌体同归于尽，而且噬菌体只侵染细菌，这为人类细菌病的治疗提供了可靠的依据。
据了解，在本次研究中通过质谱分析，他们还发现 CD-NTase 可以结合多种非特异靶目标，但其特异的靶目标尚未得到确定，因此课题组会继续跟踪研究。
同时，生物信息学分析表明，类泛素系统在细菌中广泛存在。未来，他们也会继续探索该系统的作用机理。
参考资料：
1.Ledvina, H.E., Ye, Q., Gu, Y.et al.An E1–E2 fusion protein primes antiviral immune signalling in bacteria.
Nature(2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05647-4
排版：朵克斯
